Proliferación de células precursoras de osteoblastos en la superficie de nanocables de TiO2 cultivados anódicamente en un β

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 7895 (2022) Citar este artículo

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Los estudios han demostrado que los nanotubos de TiO2 (TNT) cultivados anódicamente exhiben una excelente biocompatibilidad. Sin embargo, los nanocables de TiO2 (TNW) han recibido menos atención. El objetivo de este estudio fue investigar la proliferación de células precursoras de osteoblastos en las superficies de TNW cultivadas mediante anodización electroquímica de una aleación Ti-35Nb-7Zr-5Ta (TNZT). Se usaron superficies TNT y TNZT planas como muestras de control. Las células MC3T3-E1 se cultivaron en las superficies de las muestras durante un máximo de 5 días, y la viabilidad y proliferación celular se investigaron mediante microscopía de fluorescencia, ensayo colorimétrico y microscopía electrónica de barrido. Los resultados mostraron tasas de proliferación celular más bajas en la superficie TNW en comparación con las muestras de control sin diferencias significativas en la supervivencia celular entre las condiciones experimentales. Las mediciones de los ángulos de contacto mostraron un buen nivel de hidrofilia para los TNW, sin embargo, su diámetro relativamente delgado y su alta densidad pueden haber afectado la proliferación celular. Aunque se necesita más investigación para comprender todos los parámetros que afectan la biocompatibilidad, estas nanoestructuras de TiO2 pueden representar herramientas prometedoras para el tratamiento de defectos óseos y la regeneración del tejido óseo, entre otras aplicaciones.

El titanio y sus aleaciones tienen una alta resistencia específica (relación resistencia-peso) y la mejor biocompatibilidad entre los metales. El titanio forma naturalmente un óxido (TiO2) en su superficie, que lo protege eficazmente de la corrosión, incluso en medios acuosos. Por lo tanto, a pesar de sus costos de producción relativamente altos, el titanio es ventajoso para muchas aplicaciones, particularmente en las industrias aeroespacial1 y biomédica2. A bajas temperaturas, el titanio puro tiene una estructura cristalina compacta hexagonal, conocida como fase α, que sufre una transformación alotrópica a 882 °C en una estructura cúbica centrada en el cuerpo, conocida como fase β. Para estabilizar la fase β a temperaturas más bajas, se pueden agregar al titanio elementos de aleación como Mo, Nb, V y Ta. Las aleaciones de titanio se usan ampliamente para fabricar materiales biomédicos, en particular los que se usan para reemplazar tejidos duros. La fase β del titanio presenta un módulo elástico considerablemente bajo, lo que aumenta la compatibilidad mecánica entre el implante y el hueso. El módulo elástico de un implante debe ser lo más cercano posible al del hueso para reducir el efecto de protección contra el estrés3, que es un problema grave que puede causar pérdida de masa ósea (osteopenia) y, finalmente, provocar el fracaso del implante. Los módulos elásticos de los biomateriales de uso común, como el titanio comercialmente puro o el acero inoxidable, pueden ser hasta seis veces más altos que los del hueso4. En los últimos años, las aleaciones de titanio tipo β, basadas en el sistema cuaternario Ti-Nb-Zr-Ta, se han estudiado para aplicaciones de implantes quirúrgicos5 debido a su superior biocompatibilidad y bajos módulos elásticos. Uno de estos materiales es el Ti-35Nb-7Zr-5Ta (TNZT), una aleación de β-titanio metaestable con un módulo elástico bajo (aproximadamente 60 GPa6,7) que está libre de elementos tóxicos. Otra preocupación crítica es la capacidad del implante para osteointegrarse, es decir, para formar una fijación estable con el hueso. Cuando se inserta un implante en el cuerpo humano, genera una respuesta inflamatoria, que termina con la encapsulación del implante por moléculas de colágeno. Esta formación de cápsula es difícil de evitar, pero los materiales a base de titanio muestran una encapsulación mínima en comparación con otros metales biomédicos como el acero inoxidable y las aleaciones de Co-Cr2.

A pesar de las ventajas del titanio sobre otros biomateriales metálicos, se necesitan más avances para mejorar la osteointegración y reducir la tasa de rechazo de los implantes. Dado que la biocompatibilidad del implante está estrechamente relacionada con la topografía y la química de su superficie, las modificaciones de la superficie del titanio se han estudiado ampliamente8,9, incluido el crecimiento de nanotubos de TiO2 (TNT)10 mediante anodización electroquímica. Este último implica la aplicación de un potencial eléctrico entre el sustrato de titanio o aleación de titanio (ánodo) y un contraelectrodo (cátodo), separados por un electrolito que contiene fluoruro. La formación de TNT durante la anodización se debe a una combinación de procesos simultáneos, que pueden resumirse como una competencia entre el crecimiento asistido por campo de la capa de TiO2 y la disolución química de TiO2 por el electrolito que contiene fluoruro, que ocurre preferentemente en el tubo. base11. Durante el crecimiento anódico de los TNT, se pueden formar nanocables de TiO2 (TNW) en la parte superior de los TNT mediante un proceso de división vertical de los TNT, conocido como "modelo de división de bambú"12. La nanoestructura final se compone de TNT con TNW en la parte superior, y la longitud de los TNW puede ser incluso mayor que la de los TNT. Los parámetros de anodización requeridos para la formación de TNW pueden variar dependiendo de la composición del sustrato (ánodo), y la aleación TNZT favorece su formación13. Los TNW también se pueden sintetizar mediante otras técnicas, como electrospinning, ablación con láser y oxidación14. El término nanofibras de TiO2 (TNF) también se usa en la literatura para describir estructuras similares a las TNW. Aunque la diferencia entre estos dos términos no está clara, los TNW suelen tener diámetros del orden de decenas de nanómetros, mientras que los TNF tienen diámetros más grandes, de hasta 1 μm15. Tanto los TNW como los TNF tienen un área de superficie alta, lo que puede ayudar a que las células se adhieran y proliferen. Los estudios de biocompatibilidad de andamios fibrosos poliméricos16 han demostrado que este tipo de morfología ofrece un entorno favorable para las células, debido a su similitud con la matriz extracelular del hueso nativo. Además, los TNW de crecimiento anódico tienen la ventaja de que pueden crecer fácilmente incluso en implantes con geometrías complejas y, dado que crecen directamente del sustrato, no se necesita ningún paso adicional para unirlos a la superficie del implante.

Una cantidad significativa de estudios17 ha demostrado que los TNT son materiales biomédicos prometedores que brindan un buen soporte para la proliferación y la unión celular. Sin embargo, la biocompatibilidad de los recubrimientos TNW (o TNF) ha recibido poca atención en la literatura; los estudios que hay han tenido muchas diferencias en métodos, diseños y resultados, por lo que son difíciles de comparar18,19,20,21,22. Estos estudios se resumen en la Tabla 1. Además, la mayoría de los estudios sobre la fabricación y aplicación de estas nanoestructuras de TiO2 han empleado CP-Ti o Ti-6Al-4V, que son las aleaciones más tradicionales y comúnmente utilizadas. Mientras tanto, se debe prestar más atención a las aleaciones de titanio tipo β de bajo módulo, como TNZT, diseñadas para aplicaciones biomédicas. Además de su compatibilidad mecánica mejorada con el hueso, la aleación TNZT es ventajosa sobre CP-Ti para el crecimiento anódico de nanoestructuras de TiO2, produciendo TNT tres veces más largos y mostrando una formación mucho más fácil de TNWs13. Hasta donde sabemos, ningún estudio ha explorado el comportamiento celular en la superficie de los TNW que se cultivaron anódicamente en aleaciones biomédicas de titanio tipo β. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo investigar la biocompatibilidad de los TNW cultivados anódicamente en la aleación TNZT mediante el cultivo de células precursoras osteoblásticas en sus superficies. Se usaron superficies TNZT planas y recubiertas con TNT como muestras de control.

La aleación Ti-35Nb-7Zr-5Ta (% en peso) se produjo mediante fusión por arco voltaico de elementos puros en un crisol de cobre enfriado por agua en una atmósfera de Ar. El lingote se volvió a fundir al menos 10 veces y se volteó sobre el crisol después de cada vez para asegurar la homogeneidad. Posteriormente, se encapsuló en un tubo de vidrio de cuarzo lleno de Ar y se homogeneizó a 1000 °C durante 24 h para eliminar la microsegregación de elementos. A continuación, el lingote se laminó en frío en varias pasadas para reducir el espesor en aproximadamente un 75 %, lo que dio como resultado una placa con un espesor de 2 mm. Posteriormente, la placa se recoció bajo una atmósfera de Ar a 800 ° C (por encima de la temperatura β-transus) durante 1 h, seguido de enfriamiento rápido con agua.

La placa de aleación TNZT se cortó en piezas de aproximadamente 15 × 15 mm para la síntesis de TNW por anodización electroquímica. Las superficies de las muestras se prepararon lijando con papeles abrasivos hasta grano 1200 y se pulieron químicamente durante 10 s en una solución ácida compuesta por HF y HNO3 (1:1). La anodización se realizó en una celda electrolítica con una capacidad de volumen de aproximadamente 100 ml (50 mm de diámetro y 50 mm de altura) utilizando una malla de platino de 30 × 30 mm como cátodo. La muestra de TNZT, que era el ánodo del sistema, estuvo en contacto con la solución electrolítica a través de una ventana redonda de 8 mm de diámetro ubicada a la mitad de la altura de la celda. El ánodo y el cátodo se conectaron a una fuente de alimentación (Elektro-Automatik 8200–70, Viersen, Alemania) que operaba en modo de voltaje continuo. El electrolito se agitó continuamente durante la anodización utilizando una barra de agitación magnética. Los parámetros de anodización utilizados se basaron en un estudio previo13. Para cultivar TNW, se utilizó un electrolito orgánico que contenía etilenglicol con 0,5 % en peso de NH4F y 10 % en volumen de agua, y se aplicó un voltaje de 20 V durante 12 h. Inmediatamente después de la anodización, las muestras se enjuagaron con agua desionizada.

Se usaron muestras de TNZT planas y recubiertas con TNT como superficies de control. A pesar de que los TNT y los TNW presentan morfologías muy diferentes, ambos pueden sintetizarse mediante un proceso de anodización similar, y la obtención de uno u otro depende únicamente de los parámetros utilizados. Se eligieron muestras de TNT como control porque los TNT ya se han estudiado exhaustivamente y se sabe que presentan una biocompatibilidad excelente10. Teniendo en cuenta que los TNT son más fáciles y rápidos de obtener13, el uso de TNW anodizados como biomaterial solo estaría justificado si su biocompatibilidad fuera superior o si presentara alguna otra ventaja sobre los TNT.

Los TNT se sintetizaron con un procedimiento similar al utilizado para el crecimiento de TNW, excepto que se eligieron diferentes parámetros de anodización. En lugar del electrolito orgánico, se utilizó un electrolito acuoso que contenía 0,3% en volumen de HF y se aplicó un voltaje de 20 V durante 1 h. El electrolito acuoso limita el grosor de la capa de TiO2 y evita la formación de TNWs13. Las muestras planas se produjeron lijando las placas de TNZT con papel abrasivo hasta grano 1200 y puliéndolas químicamente durante 10 s en una solución ácida compuesta por HF y HNO3 (1:1).

La humectabilidad de las superficies TNW, TNT y TNZT planas se evaluó midiendo el ángulo de contacto entre una gota de agua y la superficie de la muestra, siguiendo los lineamientos descritos en la norma ASTM D7334-0823. Se emplearon tres procedimientos de secado diferentes antes de medir el ángulo de contacto: (i) secado con flujo de N2 durante aproximadamente dos minutos, (ii) secado al vacío y (iii) inmersión en agua desionizada durante 24 h seguido de secado al vacío. Se usó una micropipeta fijada en posición vertical para depositar suavemente 5 μl de agua desionizada en la superficie de la muestra. La forma de la gota de agua se registró utilizando una cámara microscópica digital portátil. El ángulo de contacto entre la gota de agua y la superficie se midió utilizando el complemento de ángulo de contacto para el software ImageJ24 y al menos tres muestras para cada condición.

La línea celular precursora de osteoblastos MC3T3-E1 se obtuvo de Sigma-Aldrich (ECACC, Cat. No. 99072810) y se mantuvo en medio esencial mínimo alfa (α-MEM; Pan Biotech) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Sigma-Aldrich) y penicilina/estreptomicina (Dominique Dutcher) a 37 °C y 5% de CO2, con cambio de medio cada 2 días. Cuando las células se volvieron confluentes, se separaron y se pasaron usando tripsina al 0,25% (Dominique Dutcher). Antes del cultivo celular, todas las muestras se esterilizaron con etanol (70 %) y se lavaron durante 1 h, seguido de lavado con agua y radiación ultravioleta (UV) durante 20 min. La exposición de las superficies de TiO2 a los rayos UV podría, en principio, alterar su humectabilidad, pero este cambio se invierte cuando las muestras se sumergen en el medio acuoso durante el cultivo celular. Para los experimentos de biocompatibilidad, se colocaron 80 µl de α-MEM completo que contenía 6000 células sobre las superficies planas de TNZT, TNT y TNW. Después de 3 h de incubación, se agregaron 3 ml del medio a las placas de Petri (35 mm) que contenían las muestras.

La proliferación celular se estimó midiendo la captación de éster de acetoximetilo de calceína cada 24 h. En las células vivas, la calceína no fluorescente se convirtió en calceína fluorescente verde después de la hidrólisis del éster de acetoximetilo por esterasas intracelulares. Brevemente, las células se incubaron a 37 °C durante 30 min con calceína AM 3 μM (Molecular Probes, Life Technologies), luego se lavaron con HBSS (Gibco) y se visualizaron con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse 90i. Se capturaron y analizaron al menos cinco campos seleccionados al azar por condición experimental usando una cámara Nikon DXM 1200F. Para estimar el número de células calceína positivas, se contaron los píxeles fluorescentes totales por campo, con un fondo previamente ajustado para todas las imágenes. Para el análisis se utilizó el software ImageJ versión 1.51j8 (National Institutes of Health, MD, EE. UU.).

Para el ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio), las células se incubaron a 37 °C con 0,5 mg/ml de reactivo MTT (Sigma-Aldrich). Después de 2 h, se añadieron 2 ml de 2-propanol a cada placa de cultivo y se midió la absorbancia a 560 nm utilizando un lector de microplacas (Thermo Multiskan Ex). Las mediciones de MTT se realizaron 1, 3 y 5 días después de sembrar las células.

Los resultados se expresan como la media ± SEM, y los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 7.04 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Los píxeles positivos para calceína y el análisis MTT se compararon entre los grupos a lo largo del tiempo utilizando un análisis de varianza de dos vías, seguido de la prueba post-hoc de Dunnett.

La morfología celular se observó por SEM (Hitachi S-3000N) con un voltaje de aceleración de 0,3 a 30 kV. Antes de la caracterización por SEM, las células se cultivaron en las superficies de las muestras de control y TNW durante 48 h. Posteriormente, las células se fijaron, deshidrataron, secaron y recubrieron con oro. El proceso de fijación comenzó con cuatro lavados consecutivos con tampón de cacodilato (pH 7,4) durante 15 min, fijación con glutaraldehído al 2 % en tampón de cacodilato durante 1 h y fijación con tetróxido de osmio al 1 % en tampón de cacodilato durante 2,5 h. Después de cinco lavados con H2O destilada, las muestras se incubaron con tanino al 1% en la oscuridad durante 1 h para deshidratación. A continuación, las muestras se deshidrataron con concentraciones crecientes de etanol (70 %, 80 %, 90 %, 96 % y 100 %) durante 10 min cada una y se secaron con tres soluciones de hexametildisilazano (HMDS) en las siguientes proporciones: una parte de HMDS + dos partes de alcohol 100% (20 min); partes iguales de HMDS y alcohol al 100% (20 min); y tres partes de HMDS + una parte de alcohol al 100% (20 min). Finalmente, las tres muestras se recubrieron con una capa delgada de Au utilizando un sistema de metalización por pulverización catódica Q150T-S (Quorum Technologies).

El análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) se realizó con un espectrómetro de electrónica física (PHI Versa Probe II Scanning XPS Microprobe) utilizando radiación monocromática Al Kα (1486,6 eV, 100 μm, 100 W, 20 kV) como fuente de excitación y un doble -Haz neutralizador de carga. Los espectros de alta resolución se adquirieron con una energía de paso de 29,35 eV y un haz de rayos X de 100 mm de diámetro. Se utilizó la base de datos de referencia estándar del NIST25 para indexar los espectros XPS. El análisis de difracción de rayos X (XRD) (barridos 2q) se llevó a cabo con un difractómetro Panalytical X'Pert Pro utilizando radiación Cu-ka (longitud de onda = 1,5406 Å).

Se llevó a cabo un análisis XRD de la aleación TNZT utilizada como sustrato para el crecimiento anódico de TNT y TNW para confirmar si las muestras tienen la composición de fase esperada. La figura 1 muestra el patrón obtenido. Todos los reflejos que se ven en la figura son de la fase cúbica (β) centrada en el cuerpo del titanio (base de datos del archivo de difracción de polvo: número de PDF 01-071-9955), como se esperaba para esta aleación.

Análisis XRD de la aleación TNZT utilizada como sustrato para el crecimiento anódico de TNT y TNW. Todos los reflejos observados son de la fase cúbica (β) centrada en el cuerpo del titanio.

La anodización de las muestras de TNZT en el electrolito orgánico se llevó a cabo a 20 V durante 12 h y dio como resultado que toda la superficie estuviera densamente cubierta con TNW, como se muestra en la Fig. 2a. Los TNW parecían ser muy flexibles y se agrupaban en grupos, como también se observó en un estudio anterior13. Los TNW crecieron sobre los TNT, como se observa en la Fig. 2b, de acuerdo con el modelo de división de bambú propuesto por Lim y Choi12. Los TNT tenían aproximadamente 4,6 μm de longitud y 80 nm de diámetro. La Figura 2c presenta una imagen de mayor aumento de los TNW, que muestra su crecimiento desde las paredes de TNT. La longitud precisa de los TNW fue difícil de medir debido a su morfología enredada, pero parecían tener la misma longitud que los TNT. El diámetro promedio de los nanocables fue de aproximadamente 28 nm.

Micrografías FEG-SEM de una muestra de TNZT anodizada en el electrolito orgánico a 20 V durante 12 h, lo que resultó en la formación de TNW en la parte superior. (a) Imagen de vista superior, (b) imagen de vista en ángulo y (c) imagen de vista superior con mayor aumento.

Las muestras recubiertas con TNT se obtuvieron por anodización de la aleación TNZT con el electrolito acuoso a 20 V durante 1 h. Se generaron TNT con una morfología relativamente uniforme, con paredes delgadas y bocas bien abiertas (Fig. 3a). Los nanotubos formados bajo esta condición de anodización podrían dividirse en dos grupos según sus tamaños, como se observó en un estudio anterior13. Los nanotubos del primer grupo eran más largos y anchos, con una longitud media de 1,65 μm y un diámetro de aproximadamente 109 nm. Los nanotubos del segundo grupo rodeaban a los del primer grupo (Fig. 3b) y tenían una longitud de aproximadamente 1,1 μm y un diámetro de 76 nm. La diferencia de longitud entre los dos grupos se visualizó mejor en una imagen de vista lateral (Fig. 3c).

Micrografías FEG-SEM de una muestra de TNZT anodizada en el electrolito acuoso a 20 V durante 1 h. (a,b) Imágenes de vista superior y (c) vista lateral.

La Tabla 2 proporciona una descripción general de los parámetros de anodización utilizados y las morfologías resultantes.

La Figura 4 muestra los análisis XPS para las muestras de TNT y TNW. El espectro de la encuesta (baja resolución) (Fig. 4a) muestra la presencia de elementos Ti, Nb, Zr, Ta y O, como se esperaba. Los espectros de alta resolución de Ti, Nb, Zr, Ta y O (Fig. 4b-f, respectivamente) indican la presencia de óxidos de TiO2, Nb2O5, Ta2O5 y ZrO2 (NIST Standard Reference Database25). Las curvas de energía de enlace para ambas muestras son similares. La Tabla 3 muestra la composición de elementos porcentuales en peso obtenida del análisis XPS. Aunque para la síntesis de los TNTs y TNWs se utilizaron diferentes electrolitos y tiempos de anodización, su composición química es muy similar, por lo que no se espera que influya en la biocompatibilidad.

Análisis XPS para TNT (anodización en el electrolito acuoso) (línea azul) y TNW (anodización en el electrolito orgánico) (línea roja). (a) Espectro de estudio completo y espectros de alta resolución de (b) Ti 2p, (c) Nb 3d, (d) Zr 3d, (e) Ta 4f y (f) O 1s.

La línea celular precursora de osteoblastos MC3T3-E1 se cultivó en las superficies de muestras TNW y de control (TNT y TNZT plano). La viabilidad y proliferación celular se evaluaron cada 24 h durante 5 días mediante microscopía de fluorescencia. La Figura 5 muestra una imagen representativa de células positivas para calceína para cada superficie de muestra y cada punto de tiempo evaluado. Un análisis inicial reveló que las células se adhirieron a las tres superficies y proliferaron. Como muestra la figura, las células que crecieron en las superficies de las muestras planas de TNZT y TNT tenían altas tasas de proliferación y eran completamente confluentes después de 5 días de cultivo. Sin embargo, las células que crecieron en la superficie TNW mostraron una tasa de proliferación considerablemente más baja, con un número claramente menor de células a lo largo del tiempo que en las superficies planas y TNT. Para cuantificar la proliferación celular, estimamos la intensidad de la fluorescencia en las imágenes microscópicas contando la cantidad de píxeles verdes por imagen en las condiciones experimentales (Fig. 6a). Los resultados mostraron un número similar de píxeles verdes para las muestras planas y TNT, sin diferencias significativas. Sin embargo, el número de píxeles fue significativamente más bajo para la muestra TNW en todos los puntos de tiempo evaluados y aproximadamente un 49 % más bajo que el de las otras dos muestras después de 5 días en cultivo. Además, la viabilidad de las células se evaluó mediante el ensayo MTT después de 1, 3 y 5 días de cultivo (Fig. 6b). Aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas, los resultados mostraron la misma tendencia general que los obtenidos por el método de conteo de píxeles, lo que indica que la muestra TNW tiene un menor número de células viables en comparación con las otras dos superficies después de 5 días en cultivo.

Imágenes de microscopía de fluorescencia de células MC3T3-E1 teñidas con calceína en los días 1 a 5 de cultivo en las superficies del material químicamente pulido, TNT y TNW.

Proliferación y viabilidad de las células MC3T3-E1 después de diferentes tiempos de cultivo en las superficies de las muestras de control y TNW (TNZT plano y TNT), según lo evaluado por microscopía de fluorescencia (a) y por el ensayo MTT (b). Los valores representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001 frente a muestras planas de TNZT (análisis de varianza bidireccional, seguido de la prueba post-hoc de Dunnett).

Para observar con más detalle la morfología de las células en las superficies de las diferentes muestras, se realizó SEM después de 48 h de cultivo. La figura 7 muestra imágenes de bajo aumento de las células en la superficie TNW, así como en las muestras de control (TNZT plano y TNT). Similar a las imágenes de microscopía de fluorescencia, las muestras planas y TNT (Fig. 7a, b) tenían altas densidades de células, que cubrían casi por completo las superficies. Por el contrario, la muestra TNW (Fig. 7c) mostró un número significativamente menor de células. La Figura 8 muestra imágenes de mayor aumento de las células en la superficie de las muestras planas de TNZT, TNT y TNW. Las células sembradas en muestras de TNW parecen tener una morfología y filopodios más alargados; sin embargo, futuros estudios de inmunohistoquímica, es decir, actina/vinculina, ayudarán a determinar el impacto que las diferentes superficies podrían tener en la dinámica del citoesqueleto. Además, en las imágenes SEM, se pueden observar TNW en la superficie, sin ningún daño aparente que pueda afectar la adhesión y proliferación celular.

Micrografías electrónicas de barrido de células MC3T3-E1 después de 48 h de cultivo en las superficies de las muestras (a) TNZT plana, (b) TNT y (c) TNW.

Micrografías electrónicas de barrido de células MC3T3-E1 después de 48 h de cultivo. (a) TNZT planos, (b) TNT y (c) TNW.

Una de las propiedades importantes de los biomateriales que podría explicar las diferencias observadas durante la proliferación celular en cultivo es la humectabilidad de la superficie, lo que puede afectar su biocompatibilidad. La medición del ángulo de contacto es el método más común para evaluar la humectabilidad. La Figura 9 muestra los resultados de las mediciones del ángulo de contacto para las muestras planas de TNZT, TNT y TNW (cuanto menor es el ángulo de contacto, mayor es la humectabilidad). El ángulo de contacto para las superficies planas de TNZT y TNT fue de aproximadamente 86° y 75°, respectivamente. La humectabilidad de los TNW estuvo influenciada por el método de secado después de la anodización. El secado con un flujo de N2, que es un método común para secar TNT anodizados, dio como resultado un ángulo de contacto relativamente bajo de aproximadamente 19°. Los TNW obtenidos en este estudio son largos y densos, por lo que pueden ser más difíciles de secar, lo que generó dudas sobre si el flujo de N2 fue suficiente para eliminar toda el agua que posiblemente quedó atrapada en la nanoestructura. Para aclarar esto, algunas muestras de TNW se secaron al vacío durante 24 h, lo que resultó en un ángulo de contacto significativamente mayor de aproximadamente 63°. Por lo tanto, el paso de secado al vacío antes de la medición del ángulo de contacto fue esencial para una medición correcta. Además, algunas muestras se sumergieron en agua durante 24 h antes del secado, para simular el entorno acuoso al que se someten las muestras durante el cultivo de células de osteoblastos. Esta inmersión en agua no tuvo una influencia significativa en la humectabilidad, dando como resultado un ángulo de contacto de aproximadamente 57°.

Mediciones de humectabilidad (ángulo de contacto) de las superficies planas TNZT, TNT y TNW. Se muestra la influencia del método de secado después de la anodización para las muestras TNW.

Se esperaba una mayor humectabilidad de los TNT en comparación con la de la superficie plana debido al efecto capilar10, aunque la humectabilidad puede variar significativamente según la morfología de los nanotubos y los parámetros de anodización10,26,27. Hasta la fecha, no se ha realizado ningún estudio sobre la humectabilidad de los TNW anódicos, pero su alta rugosidad superficial y permeabilidad podrían explicar su humectabilidad significativamente mayor. La revisión de Menzies y Jones28 sobre el impacto del ángulo de contacto en la biocompatibilidad de los biomateriales concluyó que, aunque se sabe que una superficie hidrofóbica reduce la biocompatibilidad, una superficie altamente hidrofílica también podría ser perjudicial porque evita las interacciones célula-célula. Lee et al.29 estudiaron el comportamiento de las células en una superficie con gradiente de humectabilidad (ángulo de contacto que varía de 30° a 90°) y observaron que a 50° las células presentaban la mejor adhesión. Parece que hay un ángulo de contacto intermedio (ni demasiado bajo ni demasiado alto) que sería óptimo. Aunque la humectabilidad de la superficie TNW parece presentar un buen valor, probablemente otros factores estén teniendo mayor relevancia en su biocompatibilidad.

Las células MC3T3-E1 mostraron una proliferación similar en las superficies de las muestras planas de TNZT y TNT, lo que indica que ambas muestras de control tenían una buena biocompatibilidad. La alta proliferación en la superficie de TNT se esperaba en base a los datos de otros estudios17, y Chang et al.22 también observaron una proliferación celular similar en las superficies de TNT y Ti plano. Como se comenta en la Introducción, solo unos pocos estudios han evaluado la actividad de las células óseas sobre superficies cubiertas con TNW o TNF (Tabla 1). Aunque algunos de estos estudios han demostrado una mayor proliferación de células en las superficies de TNW en comparación con las superficies planas, se observó una proliferación reducida o similar en cuatro de los seis estudios enumerados en la Tabla 1. Los métodos de síntesis, así como la morfología y Las dimensiones de las nanoestructuras variaron ampliamente entre estos estudios.

Se espera que la topografía y la morfología de la superficie afecten la biocompatibilidad de los TNW. Se ha informado que el diámetro del nanocable/nanofibra y el tamaño de los poros afectan la respuesta celular. Badami et al.30 estudiaron la proliferación y diferenciación de células MC3T3-E1 en fibras poliméricas con diámetros que oscilaban entre aproximadamente 140 nm y 2,1 μm y observaron que los diámetros de fibra más pequeños producían una menor densidad celular y evitaban la infiltración celular en las fibras. La infiltración es un parámetro esencial para la formación ósea porque las células se infiltran y producen proteínas de la matriz ósea16. Los diámetros de los TNW/TNF obtenidos por electrohilado18,19, oxidación térmica20 y deposición de capas atómicas21 fueron significativamente mayores que los de los TNW obtenidos en este estudio o en otros estudios que emplearon la anodización electroquímica como método de síntesis. Otra diferencia fundamental es que los nanocables desarrollados anódicamente son mucho más densos, prácticamente sin poros ni espacio libre.

Los TNW y TNF se pueden sintetizar mediante una variedad de métodos, y sus dimensiones y morfologías pueden variar significativamente según el método y los parámetros utilizados. El número de estudios sobre la proliferación de células osteoblásticas en la superficie de estas nanoestructuras es aún muy limitado y los resultados no son concluyentes. Aunque algunos estudios indican que el uso de TNW/TNF para aplicaciones biomédicas es prometedor, es necesario comprender mejor los parámetros que afectan la proliferación celular. Además, los TNW largos obtenidos por anodización electroquímica de la aleación TNZT proporcionan un área de superficie específica muy alta que podría ser ventajosa para otras aplicaciones potenciales, como catálisis31, biosensores32 y sistemas de administración de fármacos33.

Otro problema de seguridad que requiere atención es el posible daño a las nanoestructuras de TiO2 implantadas. Los implantes están frecuentemente sujetos a condiciones tribológicas que podrían resultar en la liberación de desechos sólidos y provocar reacciones inflamatorias periimplantarias. Como se explica en "Introducción", los TNW de crecimiento anódico se forman por la división vertical de los TNT durante la anodización, lo que da como resultado una morfología dual formada por nanotubos con nanocables en la parte superior. Esta nanoestructura debe protegerse de la fractura o el desprendimiento del sustrato. Para los TNTs, se pueden encontrar algunos estudios sobre su estabilidad mecánica. Shivaram et al.34 encontraron resultados prometedores, que realizaron una implantación ex vivo de titanio cubierto con TNT y no observaron daños significativos para TNT de hasta 1 mm de largo. La resistencia al corte de los recubrimientos de TNT fue estudiada por Cao et al.35 y observaron que la adhesión al sustrato es mayor para los TNT más cortos. No se encontró en la literatura ningún estudio sobre la estabilidad mecánica de los TNW anódicos, un tema que deberá abordarse en el futuro. El diámetro de los TNW anódicos es considerablemente más delgado que el de los TNW producidos por otros métodos de síntesis (Tabla 2), lo que les da una gran flexibilidad (como se ve por su morfología en la Fig. 1) debido a la tensión más baja para un radio dado de curvatura. Esta flexibilidad posiblemente podría ayudar a evitar daños mecánicos.

Este estudio evaluó la viabilidad y proliferación de células precursoras osteoblásticas MC3T3-E1 en la superficie de TNW cultivadas mediante anodización electroquímica en la aleación TNZT. Se usaron TNT revestido y TNZT plano como muestras de control. Se confirmó que la aleación TNZT es un sustrato adecuado para el crecimiento de TNW, lo que permite el crecimiento de nanoestructuras largas de TiO2. La proliferación de células MC3T3-E1 en las superficies planas de TNZT y TNT fue similar y relativamente alta. La proliferación celular en la muestra TNW fue al menos un 25 % más baja que en las muestras de control después de 5 días de cultivo. A pesar de observar que las células de la muestra TNW tenían menos actividad metabólica, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas, lo que indica que la supervivencia celular fue similar entre las tres condiciones experimentales diferentes. Los TNW mostraron un nivel moderado de hidrofilia, mientras que la humectabilidad de las muestras de control fue considerablemente mayor. Esto debería, en principio, representar una mayor biocompatibilidad para la superficie TNW; sin embargo, otros factores pueden estar jugando un papel más importante, como la topografía de la superficie y la morfología TNW. Se necesitan más estudios para comprender todos los parámetros que afectan la proliferación de células osteoblásticas en la superficie de TNW y otras nanoestructuras similares. Los TNW largos obtenidos en este estudio tienen una alta relación área superficial/volumen que también puede ser útil para otras aplicaciones.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles en el repositorio de ZENODO, https://doi.org/10.5281/zenodo.6345229.

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Este trabajo fue apoyado por la agencia brasileña de financiación de la investigación FAPESP (Fundación de Investigación de São Paulo) [Número de concesión 2019/01760-5]; la Agencia Estatal de Investigación (AEI) y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades de España a través del proyecto CALYPSOL-ATECWATER [Concesión número RTI2018-097997-B-C33]; y Comunidad de Madrid a través del programa REMTAVARES [Número de beca P2018/EMT-4341].

Escuela de Ingeniería Mecánica, Universidad de Campinas (Unicamp), Rua Mendeleyev, 200, Campinas, São Paulo, 13083-860, Brasil

leonardo fanton

Departamento de Tecnología Química y Medioambiental, Universidad Rey Juan Carlos, C/ Tulipán S/N, Móstoles, 28933, Madrid, España

Leonardo Fanton, Cristina Adán, Rafael A. García-Muñoz & Javier Marugán

Laboratorio de Apoyo a la Investigación, Hospital Universitario Fundación Alcorcón, C/ Budapest 1, Alcorcón, 28922, Madrid, Spain

Frida Loria, Mario Amores & M. Ruth Pazos

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LF diseñó el estudio, llevó a cabo parte del trabajo experimental y escribió el manuscrito principal. FL, MA y MRP realizaron e interpretaron los experimentos de biocompatibilidad, discutieron los resultados y escribieron parte del manuscrito. CA supervisó el estudio, preparó las muestras, analizó los resultados y escribió parte del manuscrito. RAG participó en la conceptualización del estudio y discusión de resultados. JM fue el supervisor principal, diseñó el estudio, analizó los resultados y participó en el proceso de redacción. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Javier Marugán.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Fanton, L., Loria, F., Amores, M. et al. Proliferación de células precursoras de osteoblastos en la superficie de nanocables de TiO2 cultivados anódicamente en una aleación de titanio biomédica de tipo β. Informe científico 12, 7895 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11981-4

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Recibido: 05 Marzo 2022

Aceptado: 04 mayo 2022

Publicado: 12 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11981-4

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