Propiedades antimicrobianas de un multi | Grupo de rosas rosadas de Guangzhou

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21427 (2022) Citar este artículo

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Las superficies de contacto de mucho tráfico, como pomos de puertas, encimeras y pasamanos, pueden ser puntos de transmisión para la propagación de patógenos, lo que enfatiza la necesidad de desarrollar materiales que se autodesinfecten activamente. Los metales se utilizan con frecuencia para estas superficies debido a su durabilidad, pero muchos metales también poseen propiedades antimicrobianas que funcionan a través de una variedad de mecanismos. Este trabajo investiga aleaciones metálicas compuestas por varios metales que individualmente poseen propiedades antimicrobianas, con el objetivo de lograr un saneamiento rápido y de amplio espectro a través de la actividad sinérgica. Se propone un paradigma de estabilización motivado por la entropía para preparar aleaciones escalables de cobre, plata, níquel y cobalto. Mediante pulverización catódica combinatoria, se prepararon aleaciones de película delgada en obleas de 100 mm con una clasificación de composición de ≈50 % de cada elemento en la oblea. A continuación, las películas se recocieron y se investigó la estabilidad de la aleación. Se realizaron pruebas de actividad antimicrobiana tanto en las aleaciones cultivadas como en las películas recocidas utilizando cuatro microorganismos (Phi6, MS2, Bacillus subtilis y Escherichia coli) como sustitutos de patógenos virales y bacterianos humanos. Las pruebas mostraron que después de 30 s de contacto con algunas de las aleaciones de prueba, Phi6, un bacteriófago de ARN monocatenario envuelto que sirve como sustituto del SARS-CoV-2, se redujo hasta 6,9 órdenes de magnitud (> 99,9999%). Además, el bacteriófago de ADN de doble cadena sin envoltura MS2 y las cepas bacterianas Gram-negativas de E. coli y Gram-positivas de B. subtilis mostraron una reducción logarítmica de 5,0, 6,4 y 5,7 en la actividad después de 30, 20 y 10 minutos. , respectivamente. La actividad antimicrobiana en las muestras de aleación mostró una fuerte dependencia de la composición, con la reducción logarítmica proporcional directamente al contenido de Cu. La concentración de Cu por separación de fases después del recocido mejoró la actividad en algunas de las muestras. Los resultados motivan una variedad de temas que pueden aprovecharse para diseñar superficies antimicrobianas ideales.

Las superficies táctiles en áreas de alto tráfico1,2,3 pueden convertirse en vectores de propagación de enfermedades a través del contacto indirecto entre personas infectadas y vulnerables4,5, por lo que es fundamental desarrollar materiales autodesinfectantes que sean efectivos contra una amplia gama de patógenos. Trabajos anteriores han demostrado que los microorganismos pueden permanecer vivos o activos en las superficies durante horas o días6,7,8,9,10, incluidos muchos patógenos humanos como el Staphylococcus aureus sensible a la meticilina (MSSA) y el Staphylococcus aureus resistente (MRSA)11, Rhinovirus12, El virus de la influenza A13, el Rotovirus14 y los coronavirus, como el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2)7,15, que ha causado la pandemia mundial de 2020-202216,17. Esta larga vida útil determina en parte el potencial de propagación de patógenos durante el contacto posterior con la superficie18. Las superficies de alto tráfico a menudo están hechas de metales, siendo el acero inoxidable (SS) una opción común debido a su costo relativamente bajo, durabilidad y resistencia a la corrosión; Se ha informado que el SS tiene propiedades antimicrobianas modestas19. Ocasionalmente, se emplea latón (CuZn), una aleación de cobre y zinc, para las superficies táctiles debido a su agradable tono dorado; sin embargo, es un metal mucho más blando, es más caro (tres veces el costo del acero inoxidable al momento de escribir este artículo) y se oxida fácilmente; la oxidación verde o negra tiende a desprenderse de la superficie, por lo que las superficies de latón requieren una limpieza regular. El latón tiene actividad antimicrobiana conocida20,21. Centrándonos en la propagación de enfermedades, muchos de los metales que muestran actividad antimicrobiana22,23,24,25,26,27,28,29,30, como el cobre (Cu), la plata (Ag) y el cobalto (Co), no son ampliamente utilizado debido a su costo y tendencia a oxidarse. Cada uno de estos metales logra actividad antimicrobiana por diferentes mecanismos contra diversos patógenos18. Al aprovechar estos mecanismos de manera sinérgica, una aleación de solución sólida de estos elementos puede ser activa contra una variedad de patógenos mayor que la suma de sus partes, lo que da como resultado una súper aleación antimicrobiana.

This work focuses on the development of multicomponent alloys of CuAgCo; each of these metals achieve antimicrobial activity through different modes of action30. Copper in-particular has shown biological activity against a wide range of viruses7,22,23,24,2 protein *. J. Biol. Chem. 274, 5474–5482 (1999)." href="/articles/s41598-022-25122-4#ref-CR31" id="ref-link-section-d80139361e648"> 31 y bacterias7,30. El modo de acción en estos sistemas se ha atribuido a las interacciones entre los iones Cu+1/+232 y las proteínas de superficie que se desnaturalizan, provocando el fallo de la envoltura viral33,34. El metal plateado se ha utilizado como agente antimicrobiano desde la antigüedad35 y puede unirse a las glicoproteínas de la superficie del virus interrumpiendo la replicación25,26,36,37. En las bacterias, los mecanismos de higienización del Ag se han atribuido al daño de la pared celular y las membranas38 ya la interferencia con las funciones celulares internas30,39. Se ha informado que el cobalto en estado Co3+ tiene propiedades antibacterianas y antivirales27,28,29 cuando forma complejos con quelantes o ligandos, posiblemente a través de bases de Schiff, un mecanismo que inactiva los sitios activos de las proteínas40. En su estado no oxidado, se ha demostrado que el cobalto es eficaz para reducir la presencia de bacterias39,41. Al desarrollar una aleación de estos metales, el material resultante puede mostrar actividad antimicrobiana debido a una variedad de mecanismos, lo que lo hace simultáneamente efectivo contra una variedad de patógenos más grande que cualquier metal. Además, los modos de acción multifacéticos pueden proporcionar propiedades de saneamiento aceleradas.

Un desafío para este trabajo es que varias de las aleaciones binarias (CoCu, AgCo, AgNi y AgCu) no se mezclan para formar aleaciones, por ejemplo, son inmiscibles42. Para superar este desafío, se utilizan dos enfoques. En el primero, se utiliza la pulverización catódica a temperatura ambiente para lograr una rápida solidificación, congelando los átomos como una aleación antes de que puedan separarse en fases43,44. En el segundo enfoque, se aprovechará un paradigma de estabilización basado en la entropía45,46. Este concepto de diseño de materiales propone que el aumento de la entropía química dentro de un sistema multicomponente aumenta el costo de energía libre de la separación de fases y, por lo tanto, puede estabilizar aleaciones de elementos que normalmente son inmiscibles47. Este enfoque se ha utilizado anteriormente para realizar nuevos materiales funcionales como catalizadores48 e imanes49,50. Para aumentar la entropía química, se agrega un elemento adicional, níquel (Ni), para formar la aleación de cuatro componentes CoCuAgNi; el níquel posee cierta actividad antimicrobiana propia51, pero se eligió principalmente porque es miscible tanto con Cu como con Co en todo su rango de composición. En composiciones ternarias ricas en Ni, CoCuNi forma una aleación monofásica. Durante el procesamiento térmico también se introduce silicio (Si), que se difunde desde el sustrato. También se hicieron intentos para aumentar aún más la entropía mediante la inclusión de hierro (Fe) y paladio (Pd), formando la aleación de cinco componentes CoCuAgFePd. Una investigación reciente ha demostrado la actividad antimicrobiana potencial de una aleación de alta entropía (HEA) que contiene cobre en dos virus52.

En el presente estudio, se preparan películas gruesas de un antimicrobiano HEA CoCuAgNi(Si) propuesto mediante pulverización catódica combinatoria y se prueba su aplicación potencial como superficies autodesinfectantes. La pulverización catódica combinatoria se ha demostrado previamente como un enfoque de alto rendimiento para diseñar superficies antimicrobianas53,54,55. La actividad antimicrobiana de la aleación preparada se prueba contra cuatro sustitutos no patógenos que representan patógenos humanos infecciosos, incluidos los bacteriófagos Pseudomonas fago Phi6, que es similar en tamaño y estructura al SARS-CoV-2, incluidas las proteínas de pico de superficie56, y el fago MS2, un virus sin picos no encapsulado y un sustituto del novovirus humano57. Las pruebas bacterianas se realizaron en el Gram-positivo Bacillus subtilis NRS 231 (ATCC: 6633) y el Gram-negativo Escherichia coli cepa Seattle 1946 (ATCC: 25,922), que sirvieron como sustitutos de las cepas bacterianas patógenas. A continuación, las películas se recocieron y se volvió a examinar la actividad antimicrobiana. El recocido es importante porque es probable que un metal desplegable para superficies táctiles se prepare mediante un procesamiento similar a alta temperatura. Tanto para las películas de crecimiento como para las recocidas, la nanoestructura y la microestructura se evalúan para probar el paradigma HEA y evaluar la relación estructura-rendimiento. Además de las películas pulverizadas, también se investiga una variedad de superficies relacionadas de un solo componente, binarias y ternarias. Este enfoque está diseñado para abordar la cuestión crítica de cómo la distribución nanoscópica de elementos dentro de una superficie afecta su actividad antimicrobiana.

Se prepararon películas delgadas de aleación (CoCuAgNi) mediante pulverización catódica combinatoria a temperatura ambiente en una oblea de Si (100) de 100 mm, como se describe en la sección Métodos, y se muestra ilustrativamente en la Fig. S1 complementaria. La técnica de pulverización catódica utiliza un plasma de Ar acelerado para generar un vapor de cada metal en fuentes de un solo elemento. Los elementos se mezclan en estado de vapor y se condensan en el sustrato de Si, y la solidificación se produce en un marco de tiempo de nanosegundos, lo que ofrece pocas oportunidades para que los elementos se difundan. Sin la oportunidad de difundirse, los elementos pueden formar una aleación metaestable, incluso si los elementos originales son inmiscibles43,44. La evidencia de aleación, en lugar de un comportamiento amorfo o vítreo, se puede ver en los datos de difracción de rayos X (XRD) que se analizan a continuación. Específicamente para la pulverización catódica combinatoria, las fuentes de pulverización catódica se disponen alrededor del sustrato en una geometría confocal; las regiones de la oblea cercanas a (lejos) de una fuente tienen una concentración más alta (más baja) del elemento de ese objetivo, por lo que se logra un gradiente de composición de ≈50% a lo largo del diámetro de la oblea.

El mapeo composicional se realizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) con espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDX), medida en 17 posiciones en la oblea. Estos mapas, que se muestran en la Fig. 1a, identifican las composiciones en los cuatro bordes extremos de la muestra como (Ni11Ag21Co13Cu55) (Ni22Ag54Co6Cu18) (Ni26Ag12Co39Cu23) (Ni55Ag22Co12Cu11), con un punto de composición equivalente ubicado cerca del centro de la oblea. Las mediciones de difracción de rayos X de la muestra cultivada, Fig. 1b, muestran picos amplios a ≈39° (d = 2,31 Å) y ≈44° (d = 2,06 Å); estos picos se alinean estrechamente con los compuestos originales: cara centrada cúbica (FCC) Ag (111) a 37,4° (d = 2,40 Å), Ag (200) a 43,5° (d = 2,08 Å) y FCC Ni (111) a 44,8 ° (d = 2,02 Å). La similitud entre estos parámetros sugiere que las películas en crecimiento poseen una estructura FCC con una microestructura policristalina. Además, para un contenido de Ag suficiente, los átomos más pequeños (Co, Cu, Ni) se integran en la red cristalina de Ag. Al disminuir el contenido de Ag, el pico a ≈39° desaparece, mientras que el pico a ≈44° se mueve a ángulos más altos, lo que indica que Ag está integrado en la red de Ni más pequeña. El sistema está inherentemente tenso debido a la gran diferencia de tamaño atómico entre el Ag (diámetro de 160 pm) y el Ni, Co y Cu (≈135 pm)58. Se puede inferir una medida cruda de la distribución de fase estructural a partir de la relación de las áreas de los picos XRD, después de corregir la caída de Fresnel, la superposición de Ag(200) y Ni(111), y el factor de forma más grande de Ag átomos El mapa resultante de la distribución de fase, Fig. 1c, confirma que el sistema experimenta una transición estructural del espaciado de red más grande al más pequeño y en el punto de composición igual, el Ag se integra en gran medida en la red de CoCuNi.

(a) Mapa de composición de Ni, Cu, Ag y Co. (b) Patrones de difracción de rayos X, tomados en las posiciones 1–17, identificados en el panel c. ( c ) Gráfico de contorno de las dos fases de FCC en el sistema de crecimiento.

Después de recocer a 600 °C durante 60 min en gas de formación que fluye (N2 + 5 % H2), las muestras desarrollaron un contraste de superficie brumosa mientras conservaban un tono gris metálico, lo que sugiere que no se oxidaron y son mucho más ásperas; el recocido a 600 ° y luego el enfriamiento al aire dio como resultado un óxido de color azul. Las mediciones de difracción de rayos X de las películas recocidas se muestran en la Fig. 2 y están indexadas a tres fases principales: Ag (FCC1), (Ni,Co)Si2 (fluorita, FCC2) y (Ni,Co,Cu)Si ( B20). Trabajos previos han demostrado que las películas de CoNi que crecen sobre sustratos de Si y se recocen en condiciones similares absorben Si del sustrato, formando estas fases59,60. La identificación de estas composiciones particulares fue informada por trabajos previos en sistemas NiCo/Si, y por comparación entre los resultados de XRD y EDX. Todos los patrones de XRD muestran picos para una fase similar a Ag (FCC1) con un parámetro de red de 4,077 Å, que coincide estrechamente con Ag a granel (4,20 Å). Las imágenes EDX en la Fig. 3, tomadas en el punto de igual composición (identificado como la posición 3 en el diagrama) muestran precipitados elipsoidales de Ag de ≈600 nm de diámetro completamente expulsados de la película. Si bien el paradigma HEA fomenta la aleación, no es una garantía absoluta, como se observa aquí. Volviendo a las reglas convencionales de diseño de aleaciones de Hume-Rothery, la diferencia máxima en los radios atómicos que se pueden acomodar en una aleación es del 15%, mientras que la diferencia entre Ag y los otros metales es > 18%; Las reglas de diseño de materiales convencionales predicen correctamente la inmiscibilidad del Ag. Cada uno de los diagramas de fase binarios también predice la inmiscibilidad de los metales 3d con Ag. Se han observado precipitados de plata en superficies antimicrobianas anteriores de Ag-diamond like carbon (DLC), lo que reduce la longevidad de los materiales, pero mejora las propiedades antimicrobianas a largo plazo54,61. El EDX también muestra Ni y Co en los precipitados. El parámetro de red ligeramente más pequeño de FCC1 en comparación con Ag a granel es probablemente el resultado de una pequeña cantidad de Ni y Co residuales que se alean en la red.

Patrones de difracción de rayos X capturados en las posiciones 1 a 17 después del recocido.

( a ) Gráfico de contorno que muestra la intensidad máxima relativa de XRD para las fases de FCC después del recocido, A (50 °) / (A (47 °) + A (50 °)), donde A es el área máxima. ( b ) Imágenes SEM y EDX de las posiciones 3, 8 y 1, identificadas en el gráfico de contorno. La barra de escala en la imagen SEM corresponde a 1000 nm.

La película debajo de los precipitados de Ag se compone de dos dominios distintos, identificados por EDX como ricos en Cu y pobres en Cu; Las regiones ricas en Cu también se identifican como pobres en Si en comparación con los dominios pobres en Cu. Las consideraciones iniciales fueron que se trataba de aleaciones (Ni,Co) y (Ni,Co,Cu)42,62, ya que la señal de Si también puede provenir del sustrato. Sin embargo, los resultados de XRD no se pueden ajustar utilizando aleaciones de NiCoCu, que se sabe que tienen un parámetro de red de ≈3,52 Å42. Trabajos previos59,60 han demostrado que el recocido de NiCo en una oblea de Si puede formar rápidamente NiSi2, CoSi y CoSi2, con calores de formación de − 50,73 kJ/mol, − 56,00 kJ/mol y − 40,7 kJ/mol respectivamente. El trabajo actual se complica aún más por la presencia de Cu. El pico XRD a 47° puede indexarse exclusivamente al pico (220) de una estructura de fluorita de NiSi2, en adelante identificada como FCC2, correspondiente a un parámetro de red de 5,42 Å; este valor está en buen acuerdo con el compuesto original, 5,44 Å. De manera similar, el pico XRD a 50° puede asociarse exclusivamente con el pico (211) de una estructura CoSi B20, correspondiente a un parámetro de red de 4,49 Å; este valor está en buen acuerdo con el compuesto original, 4,43 Å. Utilizando los picos de difracción a 47° (rojo) y 50° (azul), las distribuciones relativas de fase se trazan en la Fig. 3. El mapa de fase confirma que, cerca del borde de Ni, la película es monofásica FCC2 (NiSi2), mientras que en el rincón NiCo, la película es monofásica B20 (CoSi). Esta distribución de fases también da lugar a una distribución de la estructura electrónica de la película, siendo la fase de disilicato FCC2 predominantemente de carga neutra63, mientras que la fase de monosilicato B20 es tetravalente.

Reconociendo que las regiones ricas en Cu y pobres en Si son proporcionales en las imágenes EDX, se propone que el Cu se incorpore preferentemente a la estructura del monosilicato B20. En base a estos resultados, la muestra recocida puede describirse generalmente como una película, con dominios de (Ni,Co)Si2 y (Ni,Co,Cu)Si, con precipitados de (Ni,Co):Ag. El mapa de distribución de fases muestra grandes regiones monofásicas cerca de las posiciones 8 (B20) y 17 (FCC2). Las imágenes EDX de la posición 8 muestran cierta separación de fase química del Cu, aunque menos definida que la posición 3, a pesar de que el XRD no muestra separación de fase estructural. Se capturaron micrografías en diecisiete puntos de la muestra, aproximadamente en el mismo lugar que las mediciones XRD; tres posiciones representativas se muestran en la Fig. 3 mientras que las imágenes restantes se proporcionan en los Materiales Suplementarios Fig. S2.

Interesantes cambios microestructurales ocurren acercándose a los extremos de la oblea recocida. Acercándose al borde CoCu (posición 14), el Ag no precipita como partículas, sino que permanece como parte de la película, como un nuevo dominio. Al acercarse a los bordes de Ag y AgCu (posiciones 1 y 6), la microestructura cambia significativamente, formando una red de láminas con forma de gusano que sugiere que a temperaturas más altas puede existir una sola fase y sufre descomposición espinodal en fases ricas en Ag y Cu. Las laminillas son mucho más pequeñas que los dominios o precipitados en el resto de la película, con anchos de ≈65 nm. Las diferentes estructuras, particularmente del Ag, pueden resultar en diferentes fuerzas de actividad antimicrobiana64. Estos resultados sugieren que las composiciones ricas en Ag y CoCu pueden prepararse como aleaciones a granel y retener todos los elementos en dominios de aleación localizados. Las siguientes secciones investigan la actividad antimicrobiana de la oblea cultivada (con los elementos uniformemente entremezclados a escala atómica) y la oblea recocida (con dominios de composición y precipitados de Ag).

Se analizó una variedad de metales de un solo componente, incluidos Co, Cu, Ni y Ag, entre otros, para determinar su actividad antimicrobiana contra los microbios sustitutos. Los metales para las pruebas de un solo componente se incluyeron debido a su actividad antimicrobiana reportada contra una variedad de patógenos humanos30 o disponibilidad comercial. Antes de la prueba, las superficies se limpiaron con acetona para eliminar cualquier microbio o grasa contaminante, pero dejando la capa de óxido nativo que se esperaría en una superficie táctil desplegada. La prueba se realizó colocando 10 µL de una solución acuosa concentrada que contenía el organismo de prueba en una superficie de prueba de 25 × 25 mm2, cubriendo la mancha con un portaobjetos de vidrio estéril de 25 × 25 mm2, luego recuperando los microorganismos lavando la superficie y enumerando los microorganismos vivos, como se describe en los Métodos, y se muestra ilustrativamente en la Fig. S3 complementaria. Esta metodología fue desarrollada en base a trabajos previos65,66. Los tiempos de prueba se eligieron en función del tiempo mínimo necesario para lograr una desinfección completa con el control positivo de Cu, dentro de los límites del procedimiento de medición. Esta metodología de prueba está diseñada para simular contacto húmedo, por ejemplo, microorganismos en gotitas al respirar, estornudar o toser y no representa ensayos de contacto "seco". El metal Cu tuvo una actividad antimicrobiana significativa (p> 0.05) contra Phi6 y MS2, Fig. 4a,b (y Fig. S4 complementaria), logrando una reducción de 6.9 log de Phi6 (tiempo de prueba de 30 s) y una reducción de 7.1 log para MS2 (tiempo de prueba de 30 min). La métrica de reducción logarítmica es una escala de percentiles que se normaliza a la concentración del título para cada prueba; estos valores corresponden a los límites de detección para cada organismo respectivo. Todos los demás metales probados, incluidos nuestros metales candidatos Co, Ni y Ag, mostraron una actividad mucho menor. Entre los metales probados también destaca el zinc (Zn), que anteriormente se había informado que tiene actividad antimicrobiana contra una amplia gama de patógenos30, pero aquí parece ser débil (Figura complementaria S5). El zinc no se usó en la oblea debido a su alta presión de vapor, lo que lo hace incompatible con los sistemas de vacío de uso general. Todas las superficies probadas, excepto Cu, son estadísticamente idénticas al control de acero inoxidable (aleación 304); Se elige 304SS como control debido a su uso común para superficies de alto tránsito.

Actividad antimicrobiana de superficies de un solo componente (izquierda) y multicomponente (derecha), probada en (a, e) Phi6, (b, f) MS2, (c, g) E. coli y (d, h) B. subtilis. No se recuperó B. subtilis en el metal Cu.

El modelo gramnegativo Escherichia coli y el modelo grampositivo Bacillus subtilis también se probaron en las superficies de un solo componente, Fig. 4c, d, respectivamente. Estas medidas nuevamente muestran una fuerte actividad de Cu. Los tiempos de prueba se establecieron con base en el saneamiento total de la superficie de control de Cu; rara vez, un Phi6 activo, MS2 o vivo e. coli se recuperó debido a la variación estadística; sin embargo, no se recuperó B. subtilis en ninguna superficie de control de Cu después del ajuste inicial del tiempo de medición. Mientras que E. coli experimentó una reducción significativa de 5,9 log después de 20 min de contacto, lo que corresponde a solo una colonia enumerada en el lavado de mayor concentración. En todos los ensayos bacterianos, Ag, Co y Ni fueron de nuevo estadísticamente indistinguibles del control SS. Estos resultados sugieren que el contacto con la superficie de estos materiales a granel puede ser insuficiente para impartir actividad antimicrobiana en el marco de tiempo probado aquí. En general, Cu fue el metal más efectivo para reducir la actividad microbiana tanto en los fagos como en las bacterias. Esta fuerte actividad motivó su uso como control positivo en ensayos posteriores.

También se examinaron dos aleaciones de latón (aleación 360, Cu0.6Zn0.4 y aleación 260, Cu0.7Zn0.3) en ensayos de contacto, Fig. 4e-h; estas aleaciones contenían materiales antimicrobianos Cu y Zn (Fig. S6 complementaria). Los ensayos realizados con Phi6 en las aleaciones 260 y 360 dieron como resultado placas no contables después de 30 s de exposición, idénticas a las de Cu puro. Para el otro fago, MS2, la actividad antimicrobiana fue superior en comparación con cualquiera de las superficies de un solo componente, excepto Cu puro; La aleación 260 logró una reducción logarítmica de 5,3, mientras que la aleación 360 logró una reducción logarítmica de 4,0. Los ensayos realizados en las bacterias mostraron una tendencia similar, con las aleaciones ricas en Cu mostrando una fuerte actividad antimicrobiana: E. coli mostró una reducción logarítmica de 5,6 en la aleación 260 y no se recuperaron bacterias en la aleación 360, mientras que B. subtilis experimentó una reducción logarítmica de 5,6 en la aleación 360, mientras que B. subtilis experimentó un registro -reducción de 4,5 y 5,2 en las aleaciones 260 y 360, respectivamente.

Los resultados anteriores en conjunto respaldan el tema de que el contenido de Cu influye fuertemente en la actividad antimicrobiana en los ensayos de contacto. En una superficie desplegada, se espera que el Cu se oxide y se presente como CuO divalente o Cu2O monovalente. Si bien los cupones de Cu probados tienen una capa de óxido nativo, se espera que sea una mezcla de los dos estados. El Cu oxidado se puede preparar en cualquier estado recociendo cupones de Cu en el aire como se describió anteriormente67. Se prepararon cupones con superficies oxidadas de CuO y Cu2O. Los ensayos de contacto realizados en cupones oxidados de CuO, Fig. 4e-h, mostraron una actividad antimicrobiana comparable a la del cobre prístino, con reducciones logarítmicas de 6,5 y 4,8 para Phi6 y MS2, y no se recuperaron E. coli ni B. subtilis. Las películas de Cu2O aún mostraban actividad antimicrobiana, pero tendían a ser más específicas para microbios, con reducciones logarítmicas de 2,8, 4,9, 5,8 y 4,5 para Phi6, MS2, E. coli y B. subtilis, respectivamente. Estos resultados sugieren que el óxido divalente (Cu+2) posee propiedades antimicrobianas más fuertes que el monovalente (Cu+1).

En la investigación preliminar final, se evaluó la actividad antimicrobiana de la aleación que contiene Cu (Cu55Zn28Ni14Mn2). Esta aleación es un material candidato para la moneda acuñada de próxima generación68, lo que la hace muy relevante como superficie táctil de alto tráfico. Las monedas actuales en circulación en los Estados Unidos son aleaciones de Ni (8,3% o 25%) y Cu, o están recubiertas de Cu en el caso del centavo. Los ensayos de contacto mostraron una actividad significativa (p < 0,05) contra Phi6 (reducción logarítmica de 3,2) y E. coli (4,5) (Figura complementaria S4). Sin embargo, la actividad antimicrobiana contra MS2 (2,0) y B. subtilis (0,5) fue estadísticamente idéntica a la del control de acero inoxidable 304. Esta aleación es similar en composición a la aleación de latón 360, sin embargo, su actividad antimicrobiana es significativamente menor, lo que sugiere que el contenido de Cu no es el único motivador de la actividad.

Se prepararon películas delgadas compuestas por los metales antimicrobianos Cu, Ag, Co y Ni mediante pulverización catódica y se segmentaron en ocho cupones, correspondientes a las etiquetas 1–8 en la Fig. 5a, para realizar pruebas en ensayos de contacto; la composición en el centro de cada cupón se enumera en la Tabla 1. Como se indicó anteriormente, la rápida transformación de la fase gaseosa a una película sólida que se logra con la técnica de bombardeo iónico prepara la película como una aleación homogeneizada43,44. La actividad antimicrobiana de cada cupón se utilizó en la preparación de un mapa de calor, que se muestra para cada organismo en la Fig. 5, con la representación gráfica de barras cuantitativa que se muestra en la Fig. S6 complementaria. Para Phi6, los tratamientos con los chips 2 y 5 dieron como resultado las mayores reducciones de actividad (p < 0,05), casi en el límite de detección y comparables con el Cu puro. La actividad antimicrobiana disminuyó secuencialmente en los cupones 6, 3, 8, 4, 7 y 1. Al comparar la Fig. 5a con la Fig. 1a, la actividad antimicrobiana (reducción logarítmica) contra Phi6 sigue de cerca el contenido de Cu. Las pruebas contra el fago MS2 (Fig. 5b) tuvieron una tendencia similar, con los cupones 5, 2 y 3 mostrando la actividad más fuerte (definida como comparable con Cu puro) y disminuyendo con el contenido de Cu. Los cupones mostraron una actividad más amplia contra E. coli y B. subtilis, Fig. 5c, d, respectivamente, con los cupones 2, 5 y 6 mostrando una fuerte actividad antimicrobiana. Para E. coli, la actividad antimicrobiana siguió mostrando una dependencia directa del contenido de Cu, similar a Phi6 y MS2; sin embargo, el mapa de calor sugiere que la composición más activa contra B. subtilis está cerca del punto de ecuacomposición.

Mapa de calor de reducción logarítmica en los chips de película delgada de (a) Phi6, (b) MS2, (c) E. coli y (d) B. subtilis; reducción logarítmica en los chips recocidos de (e) Phi6, (f) MS2, (g) E. coli y (h) B. subtilis.

En todas las pruebas, el cupón n.º 1 (Cu23Co40Ni25Ag12) mostró la menor actividad antimicrobiana. Esto es notable porque los diagramas de calor tienden a indicar una fuerte dependencia del contenido de Cu; sin embargo, el cupón n.º 1 no tenía la composición de Cu más baja, los cupones 4, 7 y 8 eran todos más bajos; el cupón #1 tiene el mayor contenido de Co (40%). Este resultado nuevamente sugiere que los niveles de Cu no están impulsando completamente la actividad de la aleación. Finalmente, ninguna de las gráficas muestra ninguna sensibilidad de la distribución estructural que se muestra en la Fig. 1c.

Las películas delgadas se recocieron, lo que resultó en la separación de fases discutida anteriormente y que se muestra en las micrografías en la Fig. 3, luego se analizó la actividad antimicrobiana. Los resultados de las pruebas se muestran en mapas de calor, Fig. 5e-h, y en gráficos de barras en la (Fig. S7 complementaria). Las pruebas en Phi6, Fig. 5e, nuevamente mostraron una fuerte actividad del cupón 2 que fue estadísticamente idéntico al cupón 2 cuando creció. Sin embargo, el cupón 5 tuvo una reducción estadísticamente significativa en la actividad antimicrobiana contra Phi6 (p < 0.05) en comparación con su cupón 2. -contraparte de aleación cultivada. Todos los demás chips mostraron una mayor actividad después del recocido, sin embargo, solo el chip 7 mostró un aumento estadísticamente significativo (p <0,05).

Los mapas de calor para MS2 y E. coli muestran tendencias de actividad que son similares entre las muestras cultivadas y recocidas. Contra MS2, la oblea recocida muestra una actividad ligeramente aumentada, mientras que E. coli muestra una ligera disminución. Sin embargo, ninguna de las tendencias mostró una diferencia estadísticamente significativa entre las superficies de prueba maduras y recocidas.

Finalmente, se probó B. subtilis y los cupones 2 y 5 nuevamente mostraron una actividad significativa (Fig. 5h y S7). Sin embargo, en contraste con los otros patógenos, los otros cupones mostraron una gran reducción en la actividad en relación con la muestra aleada. Los cupones 1 y 3 aún mostraron una actividad más fuerte en comparación con el control SS, mientras que los cupones restantes (8, 6, 7 y 4) fueron estadísticamente idénticos al control SS. El proceso de recocido condujo a una pérdida significativa de actividad antimicrobiana en los chips 3, 6, 4 y 7 (p < 0,05), que eran de las regiones pesadas de Ni y Co, en comparación con los chips crecidos.

Los datos anteriores muestran la actividad antimicrobiana de las superficies de contacto para una variedad de materiales de ingeniería comunes y una película delgada aleada y de fase separada. Se eligieron cuatro metales en función de su actividad antimicrobiana previamente informada (cobre, cobalto, níquel y plata) y se prepararon como una película delgada aleado que luego se recoció, lo que resultó en la absorción de Si y la separación de fases. Mientras que el paradigma de diseño de materiales proponía realizar una aleación, estabilizada por su entropía química, la separación de fases muestra que esto no tuvo éxito, el recocido resultó en la separación de fases. Sin embargo, esto permitió probar el papel de la microestructura y la distribución química. Se realizaron ensayos de viabilidad de contacto en dos bacteriófagos sustitutos y dos bacterias, representativas de patógenos humanos comunes.

El tema predominante a lo largo de la medición fue la abrumadora actividad antimicrobiana del cobre contra todos los organismos sustitutos. En Cu puro, Phi6, el sustituto del SARS-CoV-2 se inactivó en casi 7 órdenes de magnitud después de solo 30 s. Cada uno de los otros tres microorganismos también se redujo significativamente al límite de detección después de < 30 min. La fuerte actividad antimicrobiana de Cu es consistente con informes anteriores32,34. Se han propuesto varios mecanismos de acción para respaldar la actividad antimicrobiana del Cu, incluida la ruptura de la membrana, la inactivación de enzimas, la generación de especies reactivas de oxígeno y la desnaturalización del material genético. En comparación, los metales y óxidos que no contienen cobre redujeron individualmente toda la actividad de los microorganismos en aproximadamente un solo orden de magnitud durante el mismo tiempo de prueba. Estos resultados fueron inesperados debido a la conocida actividad antimicrobiana de Zn y Ag en particular. Esto puede ser el resultado de la microestructura que parece estar relacionada con la actividad antimicrobiana, especialmente para Ag. Estos metales no se trataron antes de la prueba y, por lo tanto, es probable que tengan una capa de óxido nativo, lo que puede reducir su actividad. Sin embargo, gran parte de la actividad antimicrobiana informada enfatiza el papel del catión, que típicamente tiene un estado de oxidación de +2 y se encontraría en muchas de estas superficies de óxido nativo.

Se probó la actividad antimicrobiana del Cu y sus dos óxidos comunes, CuO y Cu2O, que representan Cu divalente y monovalente, respectivamente. Ambos óxidos mostraron una fuerte actividad, siendo el monovalente Cu2O ligeramente menos efectivo contra Phi6 (p < 0,05). La distinción entre los dos óxidos de cobre es el estado de valencia del cobre, Cu2+ para CuO y Cu1+ para Cu2O. Trabajos anteriores han enfatizado el papel crítico de los iones Cu para lograr actividad antimicrobiana contra microorganismos. Por ejemplo, en ensayos virales, los iones Cu1+ fueron responsables de generar radicales hidroxilo que condujeron a la desactivación del virus de la influenza32 y Cu2+ mostró actividad contra virus envueltos y no envueltos69. Mientras que en los sistemas bacterianos, se informa que el Cu1+ es más tóxico para las bacterias32 y puede iniciar ciclos redox que pueden dañar procesos celulares clave. Debido al corto período de tiempo de la prueba, es poco probable que los microbios causaran corrosión en la superficie, particularmente porque no se observó una caída en la actividad de los controles de metal70,71. A continuación, se ensayaron dos latones: aleación 360 (Cu0.6Zn0.4) y aleación 260 (Cu0.7Zn0.3). La aleación 260, que tiene un mayor contenido de Cu, tuvo una actividad antimicrobiana más fuerte y estadísticamente idéntica dentro de nuestro ensayo al Cu puro. Finalmente, un prototipo de moneda similar al latón, Cu55Zn28Ni14Mn2, mostró una actividad antimicrobiana moderada contra Phi6 y E. coli, pero una actividad débil contra MS2 y B. subtilis. Esto fue sorprendente porque la moneda tiene una composición similar a la aleación de latón 360, pero reemplaza el 14% del Zn con Ni. El Ni se incluye por sus cualidades anticorrosivas, apoyando la idea de que la superficie oxidada es importante para lograr la actividad antimicrobiana.

Teniendo en cuenta la actividad antimicrobiana de la película delgada (aleada) preparada, los datos sugieren que, para todos los organismos, el contenido de Cu es un factor principal en la actividad antimicrobiana. La actividad antimicrobiana de la oblea aleada contra Phi6 (Fig. 5a) se traza alejándose del objetivo de Cu a través del rayo ecuatorial de la oblea en la Fig. 6a. Se espera que estos datos sean sigmoidales, con concentraciones altas y bajas de Cu que tienen poca dependencia del % de Cu. De hecho, los datos se ajustaron bien con una variedad de funciones sigmoidales, con una función Logística de 5 parámetros que se muestra en la figura. En particular, la región 10–65 at.%, que representa la composición explorada en la oblea, es altamente lineal; un ajuste a estos datos devuelve una línea: Log(A) = 0,094 x + 1,04, donde A es la actividad antimicrobiana total y x es el % de Cu. Esta ecuación se puede arreglar para resolver la actividad total: $A={A}_{0}{e}^{cx}$, donde la intersección (x = 0) corresponde a la actividad inherente al 0% Cu (A0 = 10,9, correspondiente a una reducción logarítmica de 1,04), y c es una constante de correlación de la actividad antimicrobiana derivada del cobre (0,094). El valor de A0 concuerda bien con la actividad del acero inoxidable, que mostró una reducción de A = 9,6 (reducción logarítmica de 0,98) para Phi6 durante el período de prueba. La concordancia en estos valores respalda la relativa inactividad del acero inoxidable.

Cortes lineales de la actividad antimicrobiana para (a) Phi6, (b) MS2, (c) E. coli y (d) B. subtilis, tomados a través del rayo ecuatorial de las obleas entre Cu y Ni.

Otra característica importante de los datos de la aleación es que, dentro del rango de composición investigado (10–65 at.%), los datos no muestran ningún aplanamiento en concentraciones altas o bajas. Esto es notable porque implica que, incluso en concentraciones relativamente diluidas, el cobre sigue contribuyendo a la actividad antimicrobiana. En otras palabras, la densidad crítica del cobre para lograr alguna actividad antimicrobiana es inferior al 10% at., la concentración más baja probada aquí.

Mientras que la oblea aleada muestra una clara dependencia del contenido de Cu, la muestra recocida, también representada en la Fig. 6a, es mucho menos clara. El rayo de la muestra recocida muestra una caída apreciable de la actividad para las concentraciones altas y un aumento de la actividad para las concentraciones bajas. Esta diferencia se puede entender considerando la separación de fases mencionada anteriormente. Específicamente, las imágenes EXD (Fig. 3) mostraron que el Cu se concentra en dominios químicos específicos de la película, lo que da como resultado dominios ricos en Cu y pobres en Cu. Como resultado, la cobertura superficial efectiva del cobre sobre la película disminuye. Sin embargo, los dominios ricos en Cu mostrarán una actividad aumentada exponencialmente, como se muestra en las muestras aleadas. Dado que la actividad antimicrobiana depende exponencialmente del contenido de Cu, mientras que la cobertura del área cambia linealmente, aumenta la actividad antimicrobiana resultante en las muestras recocidas. Sin embargo, a concentraciones más altas de Cu, la actividad antimicrobiana ya es excesivamente fuerte, de modo que la concentración adicional de Cu no aumenta la actividad. Es decir, el ajuste sigmoidal muestra que el aumento de la concentración de Cu más allá del 65% at. no aumenta significativamente la actividad antimicrobiana en los marcos de tiempo probados: los fagos ya están inactivados. Por lo tanto, la separación de fases contribuye únicamente al disminuir la cobertura del área y, por lo tanto, reduce la actividad antimicrobiana aparente.

Los otros organismos se muestran en la Fig. 5b–d. De estos, MS2 muestra una tendencia similar, aunque más débil, a Phi6, con una actividad disminuida (aumentada) después del recocido a concentraciones de Cu más altas (más bajas). E. coli mostró un ligero aumento (no estadísticamente significativo) en la actividad en la muestra recocida, pero en general la tendencia cambió muy poco. Finalmente, B. subtilis mostró una disminución significativa en la actividad con el recocido. Una posible razón de esta disminución de la actividad es el gran tamaño de B. subtilis, que mide de 4 a 10 µm de largo y 0,5 µm de diámetro, en comparación con E. coli, que mide de 1 a 2 µm de largo y 0,5 µm de diámetro. . Ambas escalas de longitud son más grandes que los dominios químicos (≈700 nm) después de la separación de fases, sin embargo, B. subtilis puede ser lo suficientemente grande como para aislar las regiones dañadas por cobre. Es importante tener en cuenta que, en esta parcela, a altas concentraciones de Cu, la oblea es capaz de matar completamente la bacteria.

La Figura 6 también muestra que el tiempo de prueba para cada organismo (30 s para Phi6, 30 min para MS2, 20 min para E. coli y 10 min para B. subtilis) captura una variedad de eficacias, incluida la desinfección total. Las diferencias significativas entre estos tiempos de prueba pueden resaltar diferencias fisiológicas críticas entre los microorganismos que determinan su susceptibilidad a la superficie metálica. Específicamente, Phi6, el fago envuelto, tuvo el tiempo de prueba más corto y, por lo tanto, es más susceptible al ataque del Cu en la superficie. Esto puede indicar que el Cu, o los óxidos nativos, degradan rápidamente la membrana envolvente o pasan fácilmente a través de la membrana, lo que provoca la inactivación. Los tiempos de prueba mucho más largos (60 veces más largos) para MS2 sugieren que la cápside proteica que rodea a MS2 proporciona una protección significativa contra las propiedades antimicrobianas del Cu. Otra diferencia clave entre Phi6 y MS2 es que Phi6 tiene proteínas de pico, que son responsables de unirse al huésped bacteriano, mientras que MS2 no tiene tal estructura. La actividad antimicrobiana del Cu puede lograrse degradando o desnaturalizando de otro modo la estructura de las proteínas del pico, logrando una rápida inactivación.

Comparando las bacterias, los tiempos de prueba también son mucho más largos que Phi6, pero esto puede ser simplemente una consecuencia de su tamaño mucho mayor. Entre E. coli y B. subtilis, el tiempo de prueba más corto de B. subtilis, que también es una bacteria más grande, sugiere que es más susceptible a la actividad antimicrobiana por contacto. Esto es algo sorprendente porque B. subtilis es el sustituto grampositivo, lo que significa que tiene una pared celular exterior, compuesta de peptidoglicano enredado con ácidos teicoico y lipoteicoico de la pared, que en conjunto forman láminas de carga aniónica. Estas capas actúan como una barrera semipermeable que regula el movimiento de los cationes, a través de la unión, y se espera que protejan la membrana más frágil de la superficie metálica reactiva72. Se necesitan más estudios más allá del alcance de este trabajo para dilucidar los diversos modos de acción en estos sistemas.

En resumen, este trabajo investigó una variedad de materiales como candidatos para superficies táctiles antimicrobianas de alto tráfico73. Se eligieron cuatro metales específicos (Co, Ni, Cu y Ag) en base a la literatura previa y se prepararon como una aleación de entropía media de película delgada. Tras el recocido, la aleación tomó Si del sustrato y la fase se separó en regiones Ag, ricas en Cu y pobres en Cu. Los materiales candidatos se probaron contra cuatro microorganismos que son sustitutos de patógenos humanos virales y bacterianos comunes. Los resultados colectivos enfatizan la abrumadora actividad antimicrobiana de Cu. Los resultados clave fueron que (1) el Cu era un agente antimicrobiano eficaz incluso a bajas concentraciones, (2) la inclusión de elementos anticorrosivos tendía a suprimir la actividad antimicrobiana y (3) la actividad antimicrobiana dependía exponencialmente de la concentración de Cu. Este último resultado se equilibró con la densidad de área de Cu en las películas de fase separada (recocido), aumentando la actividad antimicrobiana sin agregar más Cu. Complementariamente a estas conclusiones, la ausencia de actividad sinérgica, particularmente en la aleación, es una observación importante. Si bien se deben realizar más pruebas para identificar las cualidades que son importantes para una aleación desplegable (como la resistencia al desgaste y la respuesta alergénica al níquel incluido), estos resultados brindan información importante sobre el papel de la microestructura en el diseño de dicho material. Juntos, estos resultados demuestran que las aleaciones que contienen cobre son superficies táctiles antimicrobianas efectivas y ofrecen una variedad de ideas que respaldan el desarrollo de superficies desinfectantes efectivas.

Algunas aleaciones binarias y de un solo elemento se compraron a McMaster Carr, incluidos Sn, Cu, SS304, Brass 360 (Cu60Zn40) y Brass 260 (Cu70Zn30); estos eran materiales de grado industrial. La placa de plata (99,9%) se adquirió de Sigma Aldrich. La muestra de Si era una oblea monocristalina de grado semiconductor (100). SiO2 era un portaobjetos de microscopio de sílice fundido. Todos los materiales se usaron tal como se recibieron sin ningún tratamiento superficial. Los óxidos de cobre (I) y (II) se prepararon recociendo placas de cobre al aire a 300 °C y 350 °C, respectivamente, durante 3 h, luego enfriando pasivamente a temperatura ambiente, también al aire.

Se prepararon obleas combinatorias mediante pulverización catódica de magnetrón en una atmósfera de Ar a partir de fuentes de un solo elemento, orientadas confocalmente alrededor de una oblea de Si (001) con recubrimiento de óxido nativo. La deposición se realizó a temperatura ambiente. La oblea no se giró durante la deposición, lo que resultó en gradientes de composición en la muestra con un espesor de película objetivo de ≈200 nm. Las composiciones se controlaron ajustando la potencia a las fuentes de bombardeo iónico, lo que dio como resultado un punto de aproximadamente igual composición ubicado en el centro de la oblea. La medición precisa de las composiciones se determinó usando espectroscopía de rayos X de dispersión de electrones (EDX) en 17 puntos a lo largo de ocho direcciones orientadas radialmente desde el centro de la oblea. Estas mediciones también capturaron mapas de vista de plano específicos de elementos de la distribución compositiva local. Se prepararon cuatro aleaciones de oblea a medida que crecían, una para cada microorganismo sustituto. Luego, las muestras recocidas se calentaron al vacío (< 10−6 Torr) o formaron gas (4 % de H2 en N2) a 600 °C y se mantuvieron durante 1 hora, luego se dejaron enfriar pasivamente durante la noche.

Las mediciones de difracción de rayos X (XRD) se realizaron utilizando una fuente Cu K-α (λ = 1.5406 Å). El eje de rotación de la muestra (θ) se fijó y la muestra se iluminó con un haz similar a un punto, mientras el eje 2θ se barría de 20° a 80°. El haz en forma de punto se produjo utilizando un morro con una abertura de 5 mm de diámetro. Luego se tradujo la muestra y se repitió la medición, capturando el patrón XRD de 17 puntos, coincidiendo aproximadamente con las mediciones EDX.

Se realizó microscopía electrónica de barrido (SEM) en las muestras recocidas y cultivadas utilizando un voltaje de aceleración de 15 keV y un detector de electrones retrodispersados. La espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX), incluido el espectro y el mapeo espacial, se realizó utilizando un detector de deriva de silicio libre de criógeno.

La composición de la moneda prototipo fue de 14,4 en peso. % Ni, 28,1 en peso. % Zn, 2,3 en peso. % Mn, resto Cu. Solo una moneda estaba disponible para la prueba de contacto. Las purezas iniciales de los materiales de partida del elemento puro fueron 0,9995 + Cu, Ni y Zn, y 0,99 + Mn. La Casa de la Moneda de EE. UU. proporcionó láminas de las aleaciones comerciales C71300 (Cu-25Ni) y C77000 (Cu-18Ni27Ni)3 para su caracterización y comparación con las aleaciones prototipo diseñadas. Las monedas se prepararon según lo descrito por Lass et al.68.

La bacteria Pseudomonas Syringae var. phaseolicola (Félix d'Hérelle Reference Center for Bacterial Viruses, University of Laval, QC Canada) se usó para la titulación de fagos y la propagación de fagos del fago Phi6 de Psuedomonas. Se usó Escherichia Coli C3000 (ATCC 15597, American Type Culture Collection, VA USA) para la titulación de fagos y la propagación de fagos del fago MS2 de E.coli (ATCC 15597-B1). Se usó Escherichia coli FDA cepa Seattle 1946 (ATCC 25922) como cepa gram negativa modelo para la prueba bactericida. Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRS 231 (ATCC 6633) se utilizó como modelo de cepa grampositiva para las pruebas bactericidas. Todas las cepas se almacenaron a -80 °C en Brain Heart Infusion (BHI) suplementada con glicerol al 15 % (peso/vol). Los cultivos de P. syringae se cultivaron en placas de agar Lysogeny Broth (LB) a 25 °C. Los cultivos de la noche a la mañana se inocularon con una sola colonia de una placa de rayas en caldo LB y se cultivaron a 25 °C en un baño de agua con agitación a 160 RPM. Ambas cepas de E. coli se cultivaron en placas de agar LB a 37 °C, y los cultivos durante la noche se prepararon como se describió anteriormente y se incubaron a 37 °CB Los cultivos subtilis se cultivaron en placas de agar BHI a 37 °C y los cultivos durante la noche se prepararon en BHI medio y cultivado a 37 °C.

Las reservas de fago para este proyecto se amplificaron mediante el método de lisado en placa. Una alícuota de cultivo durante la noche (30 μL para MS2 y 300 μL para Phi6) y 100 μL de la dilución de fago en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7,4 se alicuotó en 3–3,5 mL de agar superpuesto LB después de equilibrar a 45 °C. La mezcla se agitó brevemente, se vertió sobre la base de agar y se dejó solidificar durante 20 a 30 min. Luego, las placas se incubaron durante 18–24 h a 25 °C para Phi6 o 37 °C para MS2. Se tomaron alícuotas de cinco ml de PBS estéril en cada placa con lisis confluente y se dejó reposar durante 1 a 2 h. A continuación, se retiró el tampón de la placa con una pipeta serológica, se centrifugó a 5000 g durante 10 min a 4 °C para eliminar los residuos y, a continuación, se esterilizó por filtración utilizando un filtro de jeringa de acetato de celulosa sin surfactante (SFCA) de tamaño de poro de 0,20 μm ( Corning, Incorporated, Corning, Nueva York). Este stock esterilizado por filtración se concentró luego por centrifugación a 12.000 g durante 2 h, el sobrenadante se eliminó con una pipeta serológica y el sedimento de fago se resuspendió en PBS estéril mediante incubación estática durante la noche a 4 °C. Los stocks maestros de Phi6 se almacenaron a -80 °C en PBS suplementado con glicerol al 15 % (v/v), los stocks de trabajo se prepararon mediante lisado en placa y concentración centrífuga a partir de stock maestro recién descongelado antes de cada experimento y se almacenaron a corto plazo a 4ºC. ºC Todas las reservas de MS2 se almacenaron a 4 °C.

Los stocks bacterianos para las pruebas bactericidas se prepararon mediante la inoculación de un tubo de 5 ml del medio de crecimiento apropiado 1:100 con un cultivo de la bacteria de prueba durante la noche y se incubaron en un baño de agua con agitación a 37 °C a 160 RPM hasta que la OD600 alcanzó 0,2. Luego, el cultivo se centrifugó a 5000 g durante 10 min, se descartó el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 500 μL de PBS y se usó inmediatamente para la prueba.

La actividad antimicrobiana se determinó mediante pruebas de ensayo de contacto, adaptadas (con modificaciones) de los métodos descritos en Haldar et al. y Nakajo et al. 65,66. Toda la preparación y las pruebas se llevaron a cabo en una cabina de bioseguridad clase II. Antes de la exposición, todos los materiales de prueba se lavaron brevemente en acetona y, una vez secos, cada material se colocó en una placa de Petri estéril de 60 × 15 mm. Cada microorganismo se expuso a muestras frescas (no probadas) de Cu, Ag, Ni, Co, óxidos y latón (2,5 × 2,5 cm2). Las obleas de aleación se segmentaron en 8 chips que tenían un tamaño de 2,5 × 2,5 cm2 y cada microorganismo se analizó en un único conjunto de chips. Todos los ensayos de contacto se realizaron por triplicado y en ocasiones separadas. Para realizar el ensayo, se colocaron 10 μL de una reserva de trabajo del microbio de prueba en el centro del material de prueba, se cubrió con un portaobjetos de vidrio cuadrado de 25 × 25 mm2 y se incubó a temperatura ambiente durante el tiempo de exposición designado: Phi6 30 s, MS2 durante 30 min, E. coli durante 20 min y B. subtilis durante 10 min. Una vez transcurrido el tiempo de exposición, el portaobjetos se separó del material de prueba con unas pinzas descontaminadas con etanol al 70 % y tanto el material de prueba como el portaobjetos se lavaron tres veces con una sola alícuota de 990 μL de PBS en la placa de Petri. El lavado se recogió inmediatamente en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y luego se diluyó en serie en PBS y se enumeró mediante placas de agar de doble capa para fagos y placas de extensión para bacterias; la enumeración se realizó con 100 μL de la solución diluida. Después de la prueba, todos los materiales se descontaminaron inmediatamente en etanol al 70 % durante 30 min, luego se enjuagaron con agua desionizada, se secaron y enjuagaron con acetona antes de almacenarlos al vacío.

Para evaluar la eficacia de cada tratamiento con metal, se calculó la reducción logarítmica a partir de los recuentos microbianos y de fagos sin procesar. Se realizó una prueba de Shapiro-Wilks y si los datos no cumplían con los supuestos de normalidad, se aplicó una transformación de rango. Se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) (p < 0,05) sobre los datos (normales y transformados) para determinar cualquier diferencia significativa con el software estadístico JMP Pro 14.2 (SAS Institute, Cary, NC).

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Esta investigación fue apoyada por Science Alliance en la Universidad de Tennessee, Knoxville, a través de la Beca del Programa Colaborativo de Cohorte JDRD. Las pruebas antimicrobianas fueron apoyadas en parte por el premio NSF 2028542.

Departamento de Ciencias de la Alimentación, Universidad de Tennessee, Knoxville, TN, 37996, EE. UU.

Anne F. Murray, Daniel Bryan y Thomas G. Denes

Departamento de Ecología y Biología Evolutiva, Universidad de Tennessee, Knoxville, TN, 37996, EE. UU.

anne f murray

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Universidad de Tennessee, Knoxville, TN, 37996, EE. UU.

David A. Garfinkel, Cameron S. Jorgensen, Nan Tang, WLNC Liyanage, Eric A. Lass, Philip D. Rack y Dustin A. Gilbert

División de Ciencia y Tecnología de Materiales, Laboratorio Nacional de Oak Ridge, Oak Ridge, TN, 37831, EE. UU.

Ying Yang

Departamento de Física y Astronomía, Universidad de Tennessee, Knoxville, TN, 37996, EE. UU.

Dustin Gilberto

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DAG, TD, AFMYY y PDR concibieron y diseñaron los experimentos. AFM, DB y TD realizaron los experimentos microbianos. DAG y PDR fabricaron las obleas y EL fabricó el prototipo de la moneda. DAG, CSJ, WL y NT realizaron la caracterización de materiales. AFM, DAG y TD escribieron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la discusión y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Dustin A. Gilbert.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Murray, AF, Bryan, D., Garfinkel, DA et al. Propiedades antimicrobianas de una aleación multicomponente. Informe científico 12, 21427 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25122-4

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Recibido: 30 de septiembre de 2022

Aceptado: 24 de noviembre de 2022

Publicado: 11 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25122-4

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